多肽合成

多肽合成是一個固相合成順序一般從C端(羧基端)向 N端(氨基端)合成。過去的多肽合成是在溶液中進行的稱為液相合成法。從1963年Merrifield發展成功了固相多肽合成方法以來,經過不斷的改進和完善,到今天固相法已成為多肽和蛋白質合成中的一個常用技術,表現出了經典液相合成法無法比擬的優點,從而大大的減輕了每步產品提純的難度。多肽合成總的來說分成兩種:固相合成和液相多肽合成。

多肽是一種與生物體內各種細胞功能都相關的生物活性物質,它的分子結構介于氨基酸和蛋白質之間,是由多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結合而成的化合物。多肽是涉及生物體內各種細胞功能的生物活性物質的總稱,常常被應用于功能分析、抗體研究、尤其是藥物研發等領域。
1963年,Merrifield首次提出了固相多肽合成方法(SPPS),由于其合成方便,迅速,成為多肽合成的首選方法,而且帶來了多肽有機合成上的一次革命,并成為了一支獨立的學科——固相有機合成,固相合成的發明同時促進了肽合成的自動化。世界上第一臺真正意義上的多肽合成儀出現在1980年代初期。


多肽合成技術

1963年,Merrifield首次提出了固相多肽合成方法(SPPS),由于其合成方便,迅速,成為多肽合成的首選方法,而且帶來了多肽有機合成上的一次革命,并成為了一支獨立的學科——固相有機合成,固相合成的發明同時促進了肽合成的自動化。世界上第一臺真正意義上的多肽合成儀出現在1980年代初期。

液相合成

基于將單個N-α保護氨基酸反復加到生長的氨基成份上,合成一步步地進行, 通常從合成鏈的C端氨基酸開始,接著的單個氨基酸的連接通過用DCC,混合炭酐, 或N-carboxy酐方法實現。Carbodiimide方法包括用DCC做連接劑連接N-和C-保護氨基酸。重要的是, 這種連接試劑促接N保護氨基酸自己炭基和C保護氨基酸自由氨基間的縮水,形成肽鏈, 同時產出N,N?/FONT>-dyaylcohercylurea副產物。 然而, 此方法因其導致消旋的副反應,或在強堿存在時形成5(4H)-oxaylones和N-acylurea而受到影響。慶幸地是, 這些副反應能最小化,但是還不能完全消除。方法是加入象HoSuHoBT這樣的連接催化劑, 此外,此方法也可用于合成N保護氨基酸的活性酯衍生物。依次產生的活性酯將自發與任何別的C保護氨基酸或肽反應形成新的肽


多肽合成儀的種類

多肽合成儀是指用來合成多肽的儀器,因為多肽合成的步驟很繁瑣,又很耗時,多家公司開發了自動多肽合成儀。一般分為兩類,一類是針對數量少但合成量大的生產型應用,典型代表是美國ABI公司的ABI336型多肽合成儀,其反應器轉動方式有別于前兩代的多肽合成儀,即反應器上方相對固定,而下方作圓周360度快速旋轉,帶動反應器里的固液兩相從底部向上作螺旋運動,一直達到反應器的最上方;另外一類多肽合成儀針對于藥物研發、基因研究等科研性應用,典型代表是德國Intavis AG公司的ResPep SL和MultiPep RS系列,可以同時提供固相合成和膜合成的應用,并能自動幫助客戶進行圖譜篩選同時完成高通量的多肽合成工作。

多肽合成儀的分類 

多肽合成儀的問世大大促進了多肽科學的發展。反過來,隨著多肽科學的發展,科學家也對合成儀提出了更高的要求,從而帶動了合成儀的發展。目前多肽合成儀品種繁多,從合成量上分,可分為微克級的,毫克級的,克級的和公斤級的;從功能上分,可分為研究型的,小試型的,中試型的,普通生產型的和GMP生產型的;從自動化程度上分,可分為全自動的,半自動的和手動的;從通道上分,可分為單通道的和多通道的;從技術角度上分,可分為第一代的,第二代的,和第三代的;等等。

第一代多肽合成儀 ]第一代多肽合成儀產生時間為上世紀六十年代末至七十年代初。b]代表產品是Beckman公司推出的Beckman 990 Peptide Synthesizer[1]和Vega’s Biotechnologies公司推出的Vega’s 296 Peptide Synthesizer。如今該兩家公司均以放棄了多肽合成儀的研發與生產,我們只能在早期的學術文獻中找到其設計原理與研究情況。雖然隨著生產工藝的改進和發展,第一代多肽合成儀已全部退出了市場。但1990年以前的眾多肽化學文獻都是在此實驗設備上運行研發而來,第一代的多肽合成儀為之后的合成儀研發與制造產生了重大意義。 第二代多肽合成儀 ]第二代多肽合成儀誕生在上世紀八十年代。b]代表產品是Protein Technologies公司推出的PS3 Peptide Synthesizer以及Advanced ChemTech公司推出的ACT peptide synthesizer Model 90。標志性特點是溫和反應法合成多肽,一般可分為單純氮氣鼓泡和搖動式兩種。 PS3 的設計原理是采用氮氣鼓泡的反應方式來對反應物進行攪拌,即合成儀上反應器是固定的,氮氣從反應器的下方通過反應器到上部排出,在這一過程中產生的汽泡把固相和液相混合起來。這樣設計的好處是結構簡單,成本低,但反應相對溫和:1)有時候多肽-固相載體在靜電作用下會“抱團”,使其不能與液相充分混合,在這種情況下需要調高氮氣的壓力以消除靜電作用;而在靜電作用消除后要把壓力立刻調低,不然的話較高的壓力會把多肽-固相載體“吹”到反應器液面上方。由于多肽-固相載體具有較強的粘壁性,一旦被粘到反應器液面上方就再也無法下來,也就是無法再參加反應。顯然第一代機器是無法自動作這樣的壓力調整的,這就是造成反應“死角”的重要原因。反應死角會降低多肽合成的效率和多肽的純度,有的甚至造成合成的失敗。2)長時間氮氣鼓泡會使溶液揮發,液面降低后一部分多肽-固相載體就粘在液面上方,也無法再參加反應。3)氮氣消耗量大,運行成本增大?!CT90的設計原理是反應器在直立下圍繞原點作左右擺動,或者圓周運動。ACT的多肽合成儀同樣具有反應溫和的特點,即轉動角度與速度都不能夠完全達到氨基酸耦合的極限,反應往往需要更長的時間。 第三代多肽合成儀 ]第三代多肽合成儀誕生在上世紀九十年代b] ]代表產品是美國b]Applied Biosystems公司的ABI 433 peptide synthesizer 、C S Bio公司的CS336無死角多肽合成儀和Peptide Scientific Inc公司生產的全系列180-270度度機械攪拌多肽合成儀。。ABI433的設計原理是反應器上方相對固定,而下方作圓周360度快速旋轉,帶動反應器里的固液兩相從底部向上作螺旋運動,一直達到反應器的最上方。換句話說,溶液可以達到反應器內部的任意點,真正做到了無死角。由于攪拌速率可達每分鐘1800轉的高速,反應得以充分完全。由于無死角的攪拌方式保證的肽的合成純度,ABI433型多肽合成儀(其退出多肽合成儀市場后最后一款儀器)至今在世界上還占有著很大的比例。當然,ABI產品的售價也是最高的。由于部件使用頻率高,電磁閥會經常損壞,而ABI將7個電磁閥做成模塊化的設計,壞掉一個電磁閥必須要更換整個模塊,無形中增加了維修成本。 CS336的設計原理是反應器中點為圓心,上下做180度旋轉攪拌,攪拌速度可達180rpm,同時其采用了氮氣鼓泡反應方式的優越性,將氮氣吹動作為可選反應方式融入反應方法中,多肽合成儀在科研領域的高耦合率效果得到充分體現。 第四代多肽合成儀由于180度無死角的攪拌模式得到了越來越多的客戶的認可,Peptide Scientific Inc公司從2002年開始將180度上下翻轉的機械無極調速攪拌模式作為其開發的全系列產品的標志性特征,從PSI200、300、400、500到600全系列多肽合成儀均采用180-270度上下翻轉的機械攪拌模式,PSI采用了數控馬達系統,攪拌速度無極可調,攪拌強度和速度在物理能量上發揮到了極致。 第五代多肽合成儀美國CEM公司以蛋白質有機反應設備的制造著稱,推出了微波多肽合成儀Liberty。其采用微波加熱方式,大大提高了反應速度,將反應的速率增加到之前多肽合成儀的幾倍甚至十幾倍。其與生俱來的特點得到了很多研發型客戶的認可。 藥物篩選型多肽合成儀如ACT公司推出的106通道異步全自動多肽合成儀、AAPPTEC公司推出的96通道全自動多肽合成儀、PTI公司推出的98通道全自動多肽合成儀等。

運行原理

多肽合成儀以固相合成為反應原理,在密閉的防爆玻璃反應器中使氨基酸按照已知順序(序列,一般從C端-羧基端 向 N端-氨基端)不斷添加、反應、合成,操作最終得到多肽載體。固相合成法,大大的減輕了每步產品提純的難度。為了防止副反應的發生,參加反應的氨基酸的側鏈都是保護的。羧基端是游離的,并且在反應之前必須活化。固相合成方法有兩種,即Fmoc和tBoc。由于Fmoc比tBoc存在很多優勢,現在大多采用Fmoc法合成,但對于某些短肽,tBoc因其產率高的優勢仍然被很多企業所采用。

具體合成由下列幾個循環組成:

1) 去保護:Fmoc保護的柱子和單體必須用一種堿性溶劑(piperidine)去 除氨基的保護基團。

2) 激活和交聯:下一個氨基酸的羧基被一種活化劑所活化?;罨膯误w與游離的氨基反應交聯,形成肽鍵。在此步驟使用大量的超濃度試劑驅使反應完成。循環:這兩步反應反復循環直到合成完成。

3) 洗脫和脫保護:多肽從柱上洗脫下來,其保護基團被一種脫保護劑(TFA) 洗脫和脫保護。

基本元件

反應器

數百年來,制藥業的反應器/反應釜 設備以玻璃材質最為常見,因其完全透明且耐腐蝕,而被眾多化學、生物學專家沿用。多肽合成的過程需要操作人員直觀監測,同時合成后可進行在線切割(切割試劑TFA的強腐蝕性對反應器材質有了極大限制),這些要求限制反應器以玻璃材質最為適用。

玻璃材質的反應器在制造工藝上有極大的難度限制:①燒制工藝:磨口精度要求極高,正如很多國產設備都無法達到要求出現漏液漏氣現象,玻璃壁均勻程度等。②配合攪拌柄以及密封裝置的成套加工工藝③防爆處理

氨基酸儲罐

溶劑儲罐

量筒

轉液瓶

感應器

多端觸發器自感應定量量取法,直觀、科學、相對誤差最低。

廢液桶

廢液桶通常選擇容積較大的HDPE桶,保證通風良好,同時需安裝感應器裝置時刻檢測廢液情況,避免溢出。

控制配件

電磁閥

多肽合成儀中的電磁閥屬于敏感配件,其控制液路的串聯與閉路,在氨基酸轉移與量取,溶劑轉移與量取兩步驟中起到至關重要的作用。不同品牌的合成儀對電磁閥的設計與排布也略有不同。

控制面板

控制面板內往往含有光敏組建,部分控制電磁閥以及感應器控制組。與電腦主機的控制系統、合成儀統一的鏈接在一起,完成多肽合成的全過程。

軟件系統

多肽合成儀的操作軟件。不同品牌合成儀所注冊的軟件也不同。

檢測方法

UV Monitor

多肽合成儀中,在線檢測耦合效果的裝置,如UV Monitor往往是選配裝置,客戶可根據實驗的需要選購。其功能是讓操作者直觀的看到多肽合成的每一部氨基酸偶聯效果,從而針對特定的序列做合成設置的調整,最終達到最佳合成效果。

對于不熟悉多肽合成儀操作的用戶來說,UV Monitor是相當重要的。

試劑檢測:沒有選購在線檢測附件的多肽合成儀用戶,也可以采用試劑檢測方法做基本的耦合效果測定實驗。


固相多肽合成中,主要是通過檢測樹脂上游離氨基來判斷連接效率,檢測方法稱為Kaiser方法,其檢測結果,如果有游離氨基的時候,顯示蘭色,或紅褐色(pro,ser,His)。

Kaiser試劑包括:A,6% 茚三酮的乙醇溶液;B,80% 苯酚的乙醇溶液;C,2% 0.001M KCN的吡啶溶液

配制中的吡啶需要經過茚三酮處理后,重蒸后再使用。檢測過程,取少量樹脂,加入A,B,C各2-3滴,100℃下加熱1-2min,如果溶液有蘭色,或樹脂出現蘭色,紅褐色,表明還有游離氨基,否則說明連接完全。

其它檢測游離氨基的方法:三硝基苯磺酸法,苦味酸法,溴芬蘭法等